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酶促反应是指由一类被称为酶的特殊物质所催化的化学反应。这些物质通常是蛋白质，通过与分子(称为底物)的特殊结合发挥作用，并在不被消耗或永久改变的情况下将其转化为产物。这种结合降低了反应进行所需的活化能，从而加快了化学反应速度。酶作为高度特异性和高效的生物催化剂，广泛应用于各种工业过程，包括临床诊断、药物开发、食品和饮料、纺织工业、生物燃料生产等。了解酶动力学及其关键参数对于优化此类生物技术过程的效率和成本效益至关重要。在下一节中，我们将讨论米氏模型，它作为生物化学中理解和量化酶动力学的基本工具，为了解酶的特性和功能提供关键的见解。
米氏模型
一个简单的酶促反应可以描述如下：
其中E是酶，S是底物，ES是酶-底物复合物，P是生成产物。
当底物浓度远高于酶浓度([S]>>[E])时，在稳态假设下(ES的生成速率等于其分解速率)
酶促反应可以用米氏方程来描述，该方程将反应速度v与底物浓度[S]联系起来，表达式为(等式1)：1,2
其中：
♦ v是反应速度；
♦ Vmax为最大反应速度，即底物使所有酶活性位点饱和时的反应速度；
♦ [S]是底物浓度；
♦ Km为米氏常数，表示反应速度为Vmax值一半时的底物浓度。
当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成正比。随着底物浓度的增加，反应速度最终达到最大值(Vmax)，此时底物饱和。常数Km是衡量酶对底物亲和力的指标。Km值越低表明亲和力越高，这意味着酶在较低底物浓度下可以达到其最大速度的一半。米氏方程对于理解酶动力学至关重要，常用于通过实验测定酶参数。最常用的方法是比色测定法，它依赖于紫外/可见分光光度计来测量产物的形成，这种产物对光的吸收通常与底物不同3。荧光测定法也可用于提高动态范围和分析灵敏度4,5。本文利用荧光底物3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)研究辣根过氧化物酶HRP的活性6,7。辣根过氧化物酶(HRP)是免疫测定中最常用的标记酶之一，它在有过氧化氢(H2O2)存在的条件下催化多种供氢底物8,9。通过制备不同的底物浓度，并利用FL 6500荧光光谱仪监测荧光产物强度随时间的变化(λexc=290 nm和λm=410 nm)，构建米氏图。由于温度是影响酶活性的重要因素之一，本文使用连接到珀金埃尔默FL 6500™荧光光谱仪的Peltier系统来设置温度，同时收集荧光酶动力学，以研究温度效应。
试剂和方法
磷酸氢二钾、磷酸二氢钠二水合物、3-(4-羟基苯基)丙酸(HPPA)、辣根过氧化物酶(HRP)、30%过氧化氢(H2O2)溶液、氢氧化钠(NaOH)和乙醇(EtOH)均购自默克公司。
试剂制备方法如下：
♦ 磷酸盐缓冲液0.1 M pH 8.0 250 mL：将4.07 g磷酸氢二钾和252 mg磷酸二氢钠二水合物溶解于250 mL MiliQ水中。
♦ 底物HPPA 2.5 g/L(15 mM)溶于5 mL磷酸盐缓冲液中：首先将0.1 g HPPA溶解于2 mL EtOH(50 g/L)中。取0.25 mL体积，加入4.75 mL磷酸缓冲液中，配制成最终体积为5 mL的HPPA 2.5 g/L磷酸盐缓冲溶液。
♦ 酶HRP 80 μg/L(2 nM)溶于5 mL磷酸盐缓冲液中：取0.005 g HRP溶解于25 mL磷酸盐缓冲液中，制得0.2 g/L溶液。从HRP 0.2 g/L溶液中取0.1 mL体积，加入4.9 mL磷酸盐缓冲液，得到0.004 g/L浓度。从HRP 0.004 g/L中取0.1 mL进一步稀释，加入4.9 mL磷酸盐缓冲液中，配制成最终体积为5 mL的HRP 80 μg/L磷酸盐缓冲溶液。
♦ H2O2 0.24% v/v磷酸缓冲液：从30% v/v H2O2储备液中取0.04 mL，加入4.96 mL磷酸缓冲液中，配制成0.24% H2O2最终溶液。
将HPPA储备液(2.5 g/L)稀释在磷酸盐缓冲液中，制备不同的底物溶液(覆盖范围为0.05~0.5 g/L，最终体积为1780 μL)，以实现荧光酶测定法。对于每种荧光测定动力学，底物溶液都是直接在标准的10毫米荧光比色皿中配制的，并等待5分钟以稳定溶液温度，然后再继续添加(温度由浸入溶液中的外部探针确认)。然后通过添加50 μL HRP酶(80 μg/L)和170 μL H2O2(0.24%)来启动酶促反应，最终体积为2 mL。在最后一次添加H2O2后，采用Spectrum FL软件中的动力学方法开始荧光动力学数据采集，参数如表1所示。
表1.用于采集HPPA酶动力学的FL 6500荧光参数
如图1所示，将Peltier控制器连接到FL 6500荧光光谱仪以研究温度对HRP酶参数的影响。温度可以在Peltier控制器上手动设置。
图1.FL 6500荧光分光光度计连接到Peltier控制器以采集酶动力学数据
结果
图2显示了在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H2O2的条件下，在15°C时使用荧光底物HPPA研究HRP酶活性所获得的结果。每次荧光动力学数据采集时间为30分钟。该图显示了在所有底物浓度的动力学采集结束时在Spectrum FL软件中所示的数据。左图为相应浓度(0.05 g/L-0.5 g/L)的样品列表，以及软件根据计算时间得到的初始速度。通过改变起始值和结束值，可以轻松修改计算时间。在本研究中，由于观察到线性关系在前5分钟内有效，因此计算时间设定为0至5分钟。图2中间部分为所选荧光动力学情况([S]=0.3 g/L)，右侧部分为反应速度随HPPA浓度变化的米氏图。在米氏图下方，报告了酶参数Vmax=1148 au/min和Km=0.08 g/L。如米氏图(图2右)所示，在低底物浓度下，反应速度随底物浓度线性增加。这是因为在低[HPPA]时，可供结合的HRP活性位点数量很高，并且每个底物分子都有很高的概率找到酶。随着HPPA浓度的增加，反应速度达到稳定状态。此时，底物分子使所有HRP活性位点饱和，几乎所有可用的酶分子均与底物结合。底物浓度的进一步增加对反应速度几乎没有影响，因为所有HRP分子都已经以最大通量参与催化反应。反应速度主要受空余酶分子的可用性的限制。
为了更直观地了解酶参数，通常使用Lineweaver-Burk图(图3，右图)。它是从米氏方程推导出的双倒数图，其中反应速度的倒数与底物浓度的倒数绘制如下：
它是米氏方程的线性形式，其中Y轴的截距对应于：
X轴的截距对应于：
在Spectrum FL软件中，可以在可用模型的下拉列表中轻松选择模型：Michaelis-Menten、Lineweaver-Burk、Hofstee、Eadie-Hofstee(图3左上)。
图2.15℃时磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H2O2的条件下HRP对HPPA的酶活性。在荧光动力学数据采集结束时，结果显示在Spectrum FL软件中。包含计算时间和绘图模型的样品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的选定荧光动力学情况(中)以及包含所得Vmax和Km的米氏图(右)。
图3.15℃时磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中存在H2O2的条件下HRP对HPPA的酶活性。在荧光动力学数据采集结束时，结果显示在Spectrum FL软件中。包含计算时间和绘图模型的样品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的选定荧光动力学情况(中)以及包含所得Vmax和Km的Lineweaver-Burk图(右)。
温度效应
使用连接到FL 6500荧光光谱仪的Peltier控制器研究温度对HRP酶活性的影响。Peltier控制器允许在采集荧光动力学数据的同时为Peltier比色皿支架设置特定温度。图4显示了在15°C、37°C和45°C下得到的米氏图的比较。表2为所得的Vmax和Km。当温度从15°C升高到37°C时，Vmax从1148 au/min增加到1337 au/min，Km从0.08 g/L增加到0.09 g/L，但酶参数并未受到温度从37°C升高到45°C的影响。这可以解释为，随着温度的升高，HRP接近变性温度50-60°C，由此产生的构象变化可以修饰活性位点，进而改变其酶活性。
表2. 温度对酶参数Vmax和Km的影响
图4.存在H2O2时，在15℃(粉色)、37℃(蓝色)和45℃(黄色)获得HRP对HPPA的酶活性的米氏图。
结论
酶促反应是许多生物和生物技术过程的基础，包括药物发现、临床诊断、食品生产和生物燃料合成。研究酶催化反应为理解酶活性的机制提供了有价值的见解，有助于实现具有更高可持续性、效率和成本效益的过程。本研究在存在H2O2的条件下利用荧光底物HPPA研究了HRP的酶活性。使用FL 6500荧光光谱仪采集一系列底物浓度的荧光动力学数据。米氏图由Spectrum FL软件自动构建，该软件还可快捷地提供酶常数Vmax和Km。将荧光计连接到Peltier控制器进行动力学数据采集，以研究温度对酶活性的影响。温度从15°C升高到37°C会导致Vmax增加和Km略微增加，但温度从37°C升高到45°C时酶参数并未受到的影响。这项研究表明，连接到Peltier系统的FL 6500荧光光谱仪对于想要了解酶促反应的研究者来说是一个强大的工具。此外，借助Spectrum FL软件，可以轻松获得米氏图和酶常数，为此类分析提供快速简便的解决方案。
部件号
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