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公众号：zyzhan
自1982年第一款重组蛋白药物进入市场(第一款人胰岛素1实现商业化)以来，生物制药领域见证了蛋白质治疗药物数量的持续扩大。例如，单克隆抗体(mAb)、生长因子、激素是目前用于治疗癌症、HIV、多发性硬化症等多种疾病的生物治疗药物2。这些生物治疗药物的复杂生产工艺涉及精确的蛋白质定量，以确保最终配方的疗效和质量。此外，蛋白质还是研究酶活性、基因表达调控、信号通路和疾病机理的各种生物分子检测的关键成分。所有执行这些检测的实验室均会进行蛋白质定量分析，以揭示复杂的生物分子机制。
根据所需的精度、动态定量范围、与潜在污染物(洗涤剂、还原剂和溶剂)的相容性以及蛋白质间的差异，目前有多种方法可用于蛋白质定量。这些方法包括直接蛋白质紫外吸收测量法(A280)、铜基测定法(BCA和Lowry方法)、蛋白质-染料复合物吸收(Bradford)、荧光基测定和更复杂的测定，如ELISA或Western-Blot测定。
在本研究中，选择荧光法是基于其优异的灵敏度、特异性以及特别适合于复杂生物样品中低丰度蛋白质的检测。使用珀金埃尔默FL 6500™荧光光谱仪监测NanoOrange®荧光团与BSA非共价相互作用时观察到的荧光增强，并构建了标准曲线。
01
实验
实验
NanoOrange®蛋白质定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司，包含以下试剂:
• 缓冲液(10X)50 ml
• 500 μL BSA(牛血清白蛋白-2mg/mL)水溶液
• NanoOrange(500x)1 mL
用milliQ水将缓冲液按1:10的比例稀释，然后加入NanoOrange原液(500X)中，制备NanoOrange工作溶液(1X)。使用NanoOrange工作溶液(1X)稀释BSA蛋白原液(2 mg/mL)，以制备浓度范围为0~8μg/mL的标准样品，用于构建校准曲线。将BSA与NanoOrange荧光团混合后，在90°C下孵育10分钟以使蛋白质变性，然后按照试剂盒手册的说明冷却20分钟。
在整个样品制备过程中，溶液始终处于避光状态，以避免光漂白。由于FL 6500荧光光谱仪采用先进的光学设计和激发光束高度较低，仅需将1 mL工作溶液转移到1 cm石英比色皿中，并置于单样品池支架中。使用表1中报告的参数，应用FL Spectrum软件中的定量模式(使用λem = 600 nm处的强度进行扫描)采集荧光。对于每个BSA-NanoOrange标准溶液，荧光强度采集三次，每次采集前摇晃溶液，然后用空白(缓冲液X1)减去荧光强度，以创建标准曲线。使用三天内制备的三个独立的工作溶液系列重复检测，以验证基于荧光的检测方法。
表1. 利用FL 6500荧光参数采集BSA-NanoOrange发射和激发光谱。
02
结果
NanoOrange是一种在水溶液中荧光较弱的份菁染料，但在与蛋白质表面相互作用后，其荧光能力增强，因此适合用于基于荧光的蛋白质定量检测。首先，研究了NanoOrange在有或无4 μg/mL BSA溶液情况下的光谱行为。如图1所示，与BSA结合后，发射光谱(λexc = 470 nm)和激发光谱(λem = 600 nm)均显著增强。在λem = 600 nm附近观察到最大发射波长，并利用此波长采集荧光强度以创建标准曲线。
图1.NanoOrange与BSA(4 μg/mL)络合后荧光增强。在λexc = 470 nm处采集游离NanoOrange(蓝线)和NanoOrange+BSA(粉红线)的发射光谱。在λem = 600 nm处采集游离NanoOrange(橙线)和NanoOrange+BSA(绿线)的激发光谱。使用FL Spectrum软件的数据分析工具显示光谱。(点击查看大图)
根据试剂盒手册的说明，在构建标准曲线之前，必须加热NanoOrange-BSA复合物溶液以促进蛋白质变性并促进NanoOrange结合。通过采集NanoOrange-BSA复合物(BSA 8 μg/mL)在90°C下孵育10分钟、冷却20分钟前后的发射(λexc = 470 nm)和激发光谱(λem = 600 nm)研究加热对荧光强度的影响。图2报告了结果，证实了两个光谱的荧光增强。
图2.加热对NanoOrange+BSA溶液(8 μg/mL)的激发和发射光谱的影响。在λem = 600 nm处采集激发光谱，而在λexc = 470 nm处采集发射光谱。使用FL Spectrum软件的数据分析工具显示光谱。(点击查看大图)
在浓度0~8 μg/mL范围内建立标准曲线。在整个检测范围内，荧光强度与BSA浓度的关系图可以用四阶多项式函数3,4拟合，相关系数R2 = 0.999(图3)。在较低浓度范围内(≤1 μg/mL)，荧光强度响应与BSA浓度呈线性关系，并且该图可采用线性回归模型进行拟合，相关系数R2 = 0.994(见图4)。所有三个独立的标准溶液系列的线性(0.995和0.997)和四阶(0.991和0.998)多项式函数拟合的相关系数均高于0.99。
图3.采用四阶多项式函数拟合整个检测BSA浓度0-8 μg/mL范围内的标准浓度曲线。(点击查看大图)
图4.BSA浓度较低范围(0 ~ 1μg/mL)内的标准浓度曲线。荧光强度可以用线性回归函数来拟合。(点击查看大图)
结论 summary
经证明，NanoOrange™荧光法是一种简单且灵敏的蛋白质定量方法。FL 6500荧光光谱仪可用于监测染料与BSA偶联后的荧光增强，并可建立标准曲线。FL 6500的先进光学设计及其激发源的低光束高度允许在标准1 cm荧光比色皿中使用1 mL较小体积的溶液(标准比色皿通常使用2 mL)。
考虑到荧光法提供的高灵敏度，这比传统的比色法具有更大的优势，可以降低样品用量并扩大动态范围。运行FL 6500的FL Spectrum软件的增强安全版本完全符合21 CFR第11部分的要求，为所有需要在受监管环境中进行蛋白质定量的实验室提供了有效的解决方案。
所用耗材
参考文献
1.Clark, A. L., et al.(1982).Biosynthetic human insulin in the treatment of diabetes:a double-blind crossover trial in established diabetic patients.The Lancet,320(8294),354-357.
2.Leader, B., et al.(2008).Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nature reviews Drug discovery, 7(1),21-39.
3.Harvey, M. D., et al.(2001).Utilization of the non-covalent fluorescent dye,NanoOrange,as a potential clinical diagnostic tool:Nanomolar human serum albumin quantitation.Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications, 754(2),345-356.
4.Jones, L. J., et al.(2003).Development and characterization of the NanoOrange® protein quantitation assay:a fluorescence-based assay of proteins in solution. Biotechniques, 34(4),850-861.
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