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引言
人促红细胞生成素(EPO)是一种重要的糖蛋白药物，广泛应用于治疗贫血等疾病。EPO可以结合红系祖细胞上的相应受体促进红细胞的生成，抑制其凋亡，增加红细胞的数量，从而增加机体的氧气运输能力。然而，EPO的疗效和安全性与其N-连接糖基化(N-glycosylation)密切相关。N糖结构的微小变化可能直接影响EPO的生物学活性、稳定性和免疫原性。[1,2]因此，N糖测定成为EPO质量控制中不可少的一环。今天，我们就来聊聊N-糖测定的重要性，以及高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)在这一领域中的优势。
图1. EPO的结构
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1. EPO的N糖测定为何如此重要？
a 影响生物学活性
EPO的N糖结构直接影响其与红细胞生成素受体的结合能力，进而调控其生物学活性。EPO的3个N-糖链均可包含2-4个分支，每个分支末端均可为带负电的唾液酸，O-糖链也可带有最多2个唾液酸，这些唾液酸决定了整个分子的整体负电荷，也导致了促红素整体复杂的电荷异质性。唾液酸摩尔数量的增加可以增加促红素的半衰期。
b 决定药代动力学特性
N糖链中的唾液酸含量与EPO在体内的半衰期密切相关。唾液酸化程度高的EPO能够避免被肝脏快速清除，从而延长药效。
c 确保稳定性和安全性
N糖链可以保护EPO分子免受降解，并降低其免疫原性。如果N糖结构异常，可能导致EPO聚集或引发免疫反应，影响治疗效果。
d 监控生产工艺一致性
N糖糖谱是EPO质量控制的重要指标，能够反映生产工艺的稳定性和产品的一致性。
2. HPAEC-PAD用于N糖糖谱测定的流程
图2. EPO的N糖测定流程
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a 样品前处理流程：
● 酶解 取供试品适量，用磷酸盐缓冲液置换供试品的缓冲体系并制成每 1ml 约含人促红素蛋白 2.0mg 的溶液。取 100μl，加糖苷酶F溶液 4μl，混匀，置 37℃保温 16 小时。
● 除蛋白 加入-20℃预冷的乙醇 0.3ml，混匀，置-20℃至少 30 分钟，于 4℃不低于14000g 离心 15 分钟，取上清液，必要时采用适宜方式除盐后真空干燥，加水 0.20ml 复溶。
b 仪器配置及色谱条件：
仪 器：Dionex™ ICS-6000 型离子色谱仪
色谱柱：Dionex™ CarboPac™ PA200 色谱柱；
柱 温：30℃；
淋洗液：以50mmol/L 氢氧化钠溶液为流动相 A，以 0.2mol/L 氢氧化钠溶液为流 动相 B，以含有 50mmol/L 氢氧化钠溶液和 0.25mol/L 乙酸钠溶液为 流动相 C，梯度洗脱；
流 速： 0.5ml/min；
检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，Ag-AgCl参比电极，糖四电位波形。
图3. 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定EPO中的N糖糖谱(点击查看大图)
3. HPAEC-PAD用于N糖糖谱测定的优势
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)是目前EPO N-糖和唾液酸测定中尤其常用的技术之一。它的核心优势在于：
a) 前处理简单
该方法不需衍生，酶解后的样品可直接进样，省时省力。
b) 高灵敏度检测
脉冲安培检测器(PAD)对糖类物质具有很高的灵敏度，无需复杂的样品前处理或衍生化步骤，即可实现微量糖链的精准检测。
c) 高效分离
HPAEC-PAD利用阴离子交换色谱柱，能够高效分离复杂糖链，即使是结构相似的N-糖链也能清晰区分。
d) 定量分析能力强
HPAEC-PAD不仅可以定性分析N糖链的结构，还能精确测定各糖链的相对含量，为EPO的质量控制提供可靠数据。
e) 可与高分辨质谱联用
HPAEC与高分辨制质谱联用，可以实现单个N糖的结构确证。
4. HPAEC-PAD用于唾液酸的含量测定
EPO的不均一性很大程度上是由糖链末端唾液酸化引起的，唾液酸化程度的高低直接影响着促红素蛋白的体内半衰期，与EPO的生物学体内活性息息相关，是重要的质控指标。HPAEC-PAD对唾液酸同样有良好的检测能力。
图4. 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定EPO中的唾液酸含量(点击查看大图)
a) 与间苯二酚法相比【3】
优势：HPAEC-PAD法灵敏度和专属性更高，可同时测定不同结构操作简单。
局限：HPAEC-PAD法较间苯二酚法成本较高。
b) 与液相色谱法（HPLC）相比
优势：HPAEC-PAD测定唾液酸不需衍生，前处理更简单，节省时间和试剂，结果更准确。
局限：离子色谱不及液相色谱普及。
5. 总结
EPO的N糖糖谱和唾液酸测定是确保其质量、安全性和有效性的关键步骤，而HPAEC-PAD凭借其高分辨率、高灵敏度和强大的定量分析能力，成为这一领域尤其高效的技术。无论是科研还是生产，HPAEC-PAD都为EPO的N糖分析和唾液酸分析提供了可靠的技术支持。未来，随着技术的不断发展，HPAEC-PAD有望在更多生物制品的质量控制中发挥更大作用！
互动话题：
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参考文献：
1. 李响,秦玺,裴德宁,等. 促红素N-糖链的超高压液相色谱分析方法验证[J]. 中国新药杂志,2024,33(6):598-604.DOI:10.3969/j.issn.1003-3734.2024.06.012.
2. 李响,于雷,范文红,等. 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法用于重组人促红素中唾液酸的含量测定[J]. 中国医药导报,2018,15(27):102-105.
3. 《中国药典》2020年版
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